РЕФЕРАТ

Отчет 22 с., 1 рис., 1 табл., 37 источн. ВИРУС АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ,

Объектом исследования является вирус африканской чумы свиней (АЧС).

Основной целью исследования является тестирования наборов Skylamp ScanSpace в исполнении ASF-Scanpoint с использованием образцов биоматериалов, содержащих геном вируса АЧС.

Аналитическая специфичность тест-системы Skylamp ScanSpace в исполнении ASF-Scanpoint была определена при тестировании заведомо положительных образцов вирусного материала, содержащего наиболее актуальные генетические варианты вируса (штамм Ставрополь_01/08 генотипа II, штамм PSA-1NH генотипа I), а также заведомо отрицательных образцов, отобранных от неинфицированных животных, и интактных культур клеток макрофагов свиней. Ложноположительных или ложноотрицательных результатов при тестировании образцов не выявлено, а аналитическая специфичность составила 100 %.

Чувствительность тест-системы Skylamp ScanSpace в исполнении ASF- Scanpoint была определена при тестировании сывороток и цельной крови, отобранных на 3, 5 и 7 день после заражения вирулентным штаммом Ставрополь_01/08 в дозе 3 lg ГАЕ50. Было продемонстрировано, что с использованием тест-системы Skylamp ScanSpace в исполнении ASF- Scanpoint геном вируса АЧС был выявлен в 100% случаев при тестировании образцов сыворотки свиней, цельной крови, отобранных на 3-7 сутки после заражения, и образцов смывов с носовой полости, отобранных на 5-7 сутки после заражения, Наборы Skylamp ScanSpace и РеалБест-Вет ДНК ASFV (Африканская чума свиней) («Вектор-БЕСТ» Россия) показали сходные показатели чувствительности и специфичности при тестировании небольшого числа сывороток.

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящем отчете о НИР применяют следующие термины с соответствующими определениями:

• Геном — совокупность наследственного материала, заключенного в клетке организма. Геном содержит биологическую информацию, необходимую для построения и поддержания организма.

• Дезоксорибонуклеиновая кислота (ДНК) — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков.

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК в биологическом материале (пробе).

• Изотермическая амплификация - процесс образования дополнительных копий определенных участков ДНК или РНК, протекающий при постоянной температуре.

• Аналитическая специфичность – способность теста обнаруживать только искомое вещество или его маркер.

• Валидация - подтверждение на основе представления объективных свидетельств того, что требования, предназначенные для конкретного использования или применения, выполнены, декларируемые свойства и характеристики подтверждаются, а поставленная цель (предназначение системы, комплекса, устройства и т. д.) достигнута.

• Праймер — короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, который служит стартовой точкой при репликации ДНК. Праймеры необходимы ДНК- полимеразам, так как ДНК-полимеразы могут только наращивать существующую цепь.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

В настоящем отчете о НИР применяют следующие сокращения и обозначения:

• АЧС − африканская чума свиней ГАЕ − гемадсорбирующие единицы

• ГК ФИЦВиМ − государственная коллекция ФГБНУ ФИЦВиМ ДНК − дезоксирибонуклеиновая кислота

• КЧС − классическая чума свиней ПЦР − полимеразная цепная реакция

• РРСС - репродуктивно-респираторный синдром свиней ТГС - трансмиссивный гастроэнтерит свиней

• ФГБНУ ФИЦВиМ - ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии

• ЦВС - цирковирус свиней dpi – день после инфекции

• LAMP - петлевая изотермическая амплификация

• WOAH - Всемирной организации охраны здоровья животных

  
  

1 Введение

Вирусные заболевания сельскохозяйственных животных приводят к существенному экономическому ущербу различных отраслей животноводства. В Российской Федерации ежегодно регистрируют случаи опасных инфекционных болезней животных, таких как африканская чума свиней (АЧС). АЧС - вирусное заболевание свиней, смертность от которого приближается к 100%. Несмотря на свою незоонозную природу и узкий круг хозяев, АЧС является заболеванием, подлежащим регистрации в соответствии с руководящими принципами Всемирной организации охраны здоровья животных (WOAH), из-за ее значительных социально- экономических последствий и потенциала трансграничного распространения.

Несмотря на многолетние исследования и некоторые успехи в разработке вакцин, вирус АЧС остается большой угрозой для свиноводческой отрасли во всем мире. Болезнь распространена во многих странах с развитым свиноводством, что приводит к значительным экономическим потерям и негативно сказывается на глобальной продовольственной безопасности. Случаи болезни регулярно регистрируются на территории России, в странах Европы, а с 2018 года и в странах Азии, включая Китай. С момента появления первых случаев АЧС в 2007 году свиноводческая отрасль России испытывает серьезные экономические потери от вспышек данной опасной болезни животных (рисунок 1). Ограничительные карантинные мероприятия дополнительно увеличивают ущерб от вспышки за счет вынужденного убоя восприимчивого поголовья. Существенное снижение численности диких кабанов в связи с отстрелом и гибелью инфицированных животных грозит и серьезными экологическими проблемами. В связи с широким распространением и важными социально- экономическими и экологическими последствиями такого распространения, вирус АЧС является одним из важнейших объектов изучения ветеринарной вирусологии. Возбудителем АЧС является вирус – представитель семейства Asfarviridae – единственный известный ДНК-содержащий арбовирус. Геном вируса представлен двухцепочечной ДНК длиной около 190 т.п.н. и кодирует более 170 белков [1].

Генотипирование на основе гена B646L (кодирующего белок p72) позволило идентифицировать не менее 24 генотипов вируса АЧС [2,3,4,5,6]. Другая классификация, основанная на типировании в реакции задержки (ингибировании) гемадсорбции (РЗГАд) и классических экспериментах по вакцинации/заражению, разделила изоляты вируса АЧС, на восемь отдельных серогрупп (серотипов), хотя, вероятно, серогрупп существует больше [7,8,9].

Наиболее разнообразные генотипы и серотипы вируса АЧС распространены в странах Африки к югу от Сахары, где их распространению способствует инфекционный цикл между мягкими клещами рода Ornithodoros и естественными хозяевами-млекопитающими, в первую очередь бородавочниками (Phacochoerus sp.) [11,12]. После того, как вирус АЧС генотипа II был занесен из Восточной Африки в Грузию [13], он начал циркулировать в Восточной Европе (с 2007 г.), в Западной Европе (с 2014 г.), в Азии (с 2018 г.), в Америке (с 2021 г.) и Океании (с 2020 г.) [14]. В 2021 г. низковирулентные изоляты генотипа I вируса АЧС были обнаружены в популяции домашних свиней в Китае [15]. Эти изоляты показали высокое генетическое сходство с негемадсорбирующими естественно ослабленными вариантами, выделенными из вспышек АЧС в Португалии в XX веке. В 2023 году высоковирулентные рекомбинанты генотипов I и II вируса АЧС были выделены в Китае, Вьетнаме и России [16-19].

Вакцины против АЧС в России не зарегистрированы. В настоящее время в некоторых странах Азии лицензированы и доступны две живые ослабленные вакцины (LAV) против АЧС - AVAC ASF LIVE (AVAC Viet Nam JSC, Вьетнам) и NAVET-ASFVAC (Navetco Central Veterinary Medicine Company, Вьетнам). Обе эти вакцины основаны на рекомбинантных штаммах генотипа II вируса АЧС с делецией генов, связанных с вирулентностью [22- 25]. Кроме того, в последние годы было разработано несколько кандидатных живых аттенуированных вакцин против АЧС, обладающих различной степенью защиты [24, 26-34]. Некоторые из этих кандидатов, вероятно, безопасны, хотя другие показали различные побочные эффекты у вакцинированных животных. Однако использование живых вакцин сопряжено со многими рисками, и необходимы множество исследований их безопасности.

У домашних свиней, инфицированных вирусом АЧС, в зависимости от вирулентности вирусного штамма и возраста животного, проявляются различные клинические признаки, от острых до хронических. Высоковирулентные штаммы вируса АЧС вызывают острую инфекцию, при этом показатели смертности приближаются к 100%. Умеренно вирулентные штаммы часто вызывают подострую или хроническую инфекцию, показатели смертности при этом варьируются от 30% до 70%. Следует отметить, что в России циркулируют высоковирулентные изоляты генотипа II [20,21], а также был выделен высоковирулентный изолят, представляющий собой рекомбинант генотипов I и II [19].

В настоящее время основными методами борьбы с распространением АЧС остаются биологический контроль и выбраковка животных, которые приводят к огромным экономическим потерям. Таким образом, именно разработка новых и усовершенствование существующих методов лабораторной диагностики АЧС является одной из ключевых задач в борьбе с распространением возбудителя. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и его модификации применяются для диагностики и профилактики не только бактериальных, но и вирусных инфекций, в том числе для африканской чумы свиней (АЧС) по всему миру. Обнаружение вирусной нагрузки до появления клинических признаков имеет большое значение для эффективной борьбы с АЧС в свиноводстве.

Одним из наиболее распространенных типов изотермической амплификации является петлевая изотермическая амплификация (LAMP). В данном подходе используется набор из 4-8 нуклеотидных затравок (праймеров) для распознавания нескольких областей на целевой последовательности ДНК, при этом амплификация происходит в результате последовательного вытеснения полимеразой цепей ДНК. Реакционные смеси содержат Mg, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов и инжиниринговый фермент Bst ДНК полимераза или большой фрагмент Bst ДНК полимеразы. Используемой оценкой прохождения реакции могут быть как колориметрические, так и флуоресцентные методы детекции в зависимости от используемых реакционных смесей.

Для выявления вируса АЧС был разработан прототип диагностического набора, основанный на изотермической амплификации. По данным литературы этот метод считается быстрым, простым, обладает высокими показателями чувствительности и специфичности, а также активно применяется в коммерческих тест системах. Разработанный ООО “Скайлэмп” прототип набора может служить полезным вспомогательным диагностическим инструментом для раннего выявления АЧС на сельскохозяйственных площадках с привлечением минимальных трудозатрат в качестве point of care диагностики. Существенным моментом создания генетических ПЦР тест систем является дизайн праймеров. Разработка праймеров была проведена in silico с использованием общедоступных полногеномных последовательностей вируса АЧС. В качестве целевого участка был выбран консервативный регион гена B646L кодирующий структурный белок p72, относительно которого были подобраны 4 пары праймеров для проведения изотермической петлевой ПЦР. Для контрольной реакции был выбран регион d петли в митохондриальной ДНК свиньи. С целью подтверждения возможности использования разработанного набора «Сканпойнт АЧС» в качестве вспомогательного инструмента для диагностики АЧС необходимо провести исследования его характеристик (включая чувствительность и специфичность) с использованием актуальных для России вариантов вируса АЧС.

2 Материалы и методы

2.1 Вирусы

В работе использованы штаммы вируса АЧС: Ставрополь_01/08, PSA- 1-NH. Штаммы вируса АЧС были получены из ГК ФИЦВиМ. Вирусные стоки были накоплены в культуре клеток макрофагов свиней в рамках выполнения ГЗ и хранились в рабочей коллекции лаборатории Геномики вирусов. Панель сывороток и крови инфицированных животных, отобранных на 3, 5 и 7 дни после заражения (dpi), а также сыворотки и кровь здоровых (неинфицированных) животных. Кроме того, в работе были использованы смывы с носовой полости инфицированных животных, отобранных на 5 и 7 дни после заражения (dpi). Животные были инфицированы штаммом Ставрополь_01/08 в дозе 3 lg ГАЕ50. Эксперименты по инфицированию животных и отбору образцов были выполнены в рамках ГЗ ФГБНУ ФИЦВиМ в 2023-2024 гг. Образцы хранились в рабочей коллекции лаборатории Геномики вирусов.

2.2 Культуры клеток

В работе использована первичная культура клеток макрофагов свиней, полученная из периферической крови свиней-доноров, свободных от патогенов свиней.

2.3 Растворы и реактивы

Комплект тестов «Сканпойнт АЧС» (ООО СКАЙЛЭМП, Россия), этиловый спирт 75%, среда RPMI 1640 («Биолот», Россия), фетальная сыворотка крупного рогатого скота (Cytiva, США), фиколл (ПанЭко, Россия), наборы для выделения ДНК и постановки ПЦР («Вектор-БЕСТ», Россия).

2.4 Расходные материалы

Наконечники для дозаторов 10-100 мкл (с фильтром); наконечники для дозаторов 10-200 мкл (без фильтра); наконечники для дозаторов 100-1000 мкл (с фильтром); наконечники для дозаторов 0,1-10 мкл (с фильтром); пипетки серологические 5 мл; планшеты культуральные 96-луночные; микропробирки 1,5 мл; центрифужные пробирки 50 мл; шприцы 20 мл; фильтрационные шприцевые насадки.

2.5 Лабораторное оборудование

Ламинар 2-го класса безопасности («Ламинарные системы», Россия); термоциклер T100 («Bio-Rad Laboratories», США); амплификатор Real-time CFX96 Touch («Bio-Rad Laboratories», США); станция Skylamp ScanSpace для проведения изотермической реакции; микроскоп флуоресцентный инвертированный Olympus CKX53 (Olympus, Япония); микроцентрифуга

«Eppendorf» («Eppendorf», Германия); автоматические дозаторы на 10 мкл, 20 мкл, 100 мкл и 1000 мкл («Ленпипет», Россия; «Eppendorf», Германия; Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Китай); вортекс («Biosan», Латвия); холодильники («Атлант», Россияи; «Sanyo», Япония); СО2-инкубатор («Sanyo», Япония); мерные цилиндры.

2.6 Титрование вируса АЧС в культуре клеток

Титрование вируса АЧС проводили в культуре клеток макрофагов свиней в 96-луночных планшетах для культивирования культур клеток. Вируссодержащий материал вносили в лунки в разведениях от 10-1 до 10-8 в среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной сыворотки КРС. После добавления 1% суспензии эритроцитов культуральные планшеты инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 7 суток. Планшеты ежедневно просматривали под микроскопом и отмечали появление гемадсорбции в лунках. По окончанию титрования определяли инфекционную активность вируса по методу Рида и Менча [35] и выражали в lg ГАЕ50/см3 (lg HAD50/mL). Титр рассчитывали на основании трех независимых экспериментов.

2.7 Выделение ДНК и проведение ПЦР в режиме реального времени

Выделение суммарной ДНК проводили с использованием набора

«РеалБест-Вет Гамма» («Вектор-БЕСТ», Россия) согласно инструкции производителя. Постановку ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использованием набора «РеалБест-Вет ДНК ASFV (Африканская чума свиней)» («Вектор-БЕСТ», Россия), а также образцов выделенной ДНК, согласно инструкции производителя.

2.8 Проведение изотермической ПЦР

Изотермическую ПЦР проводили на приборе Skylamp ScanSpace с использованием тестов «Сканпойнт АЧС» (ASF-Scanpoint) (ООО СКАЙЛЭМП, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Вкратце, 20 мкл сыворотки (вируссодержащего материала) добавили в буфер (1 мл) при помощи одноразового дозирующего устройства (предоставлены производителем). Образец перемешивали 5 раз переворачиванием пробирки. Полученную смесь вносили в специальный картридж для реакции. Затем картридж помещали на станцию Skylamp ScanSpace для проведения изотермической реакции. Реакцию проводили в течение 45 минут, после чего результаты снимались в формате колориметрической ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя.

3 Результаты

1. Аналитическая специфичность тест-системы Skylamp ScanSpace в исполнении ASF-Scanpoint была определена при тестировании заведомо положительных образцов вирусного материала, содержащего наиболее актуальные генетические варианты вируса (штамм Ставрополь_01/08 генотипа II, штамм PSA-1NH генотипа I), а также заведомо отрицательных образцов, отобранных от неинфицированных животных, и интактных культур клеток макрофагов свиней. В качестве заведомо положительных образцов для исследования на данном этапе были исследованы образцы сыворотки, крови, смывы с ротовой и носовой полости от инфицированных животных с клиническими признаками болезни. Данные образцы не содержали геномы основных вирусных патогенов свиней, таких как цирковирус свиней (ЦВС), вирус болезни Ауески, вирус классической чумы свиней (КЧС), вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС), вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС), что было подтверждено ранее с использованием коммерческих наборов («Вектор- БЕСТ», Россия).

Тесты «Сканпойнт АЧС» продемонстрировали высокую специфичность в отношении всех анализированных штаммов АЧС, (штамм Ставрополь_01/08 генотипа II, штамм PSA-1NH генотипа I). Все заведомо положительные образцы были выявлены с использованием предложенной тест-системы. При тестировании заведомо отрицательных образцов были получены отрицательные результаты. Таким образом, ложноположительных или ложноотрицательных результатов при тестировании образцов не выявлено, а аналитическая специфичность составила 100 %.

2. Чувствительность тест-системы Skylamp ScanSpace в исполнении ASF-Scanpoint была определена при тестировании сывороток и цельной крови (с ЭДТА), отобранных на 3, 5 и 7 день после заражения вирулентным штаммом Ставрополь_01/08 в дозе 3 lg ГАЕ50, и смывов с носовой полости отобранных на 5 и 7 день после заражения вирулентным штаммом
Ставрополь_01/08 в дозе 3 lg ГАЕ50. Следует отметить, что штамм Ставрополь_01/08 генетически схож с изолятами вируса АЧС, которые выделены в России в последние годы. Генетические изменения, которые отмечают у российских изолятов, незначительные, преимущественно связаны с вариабельными областями генома и не затрагивают последовательность гена р72 (B646L) вируса АЧС. Используемая доза для заражения (3 lg ГАЕ50) вызывает развитие острой формы течения болезни со смертностью 100%. Инфицированные животные имеют лихорадку, угнетение с 3-5 дней после инфекции, а гибель наступает на 6-8 день после инфекции [36,37].

Образцы сывороток и крови, отобранные на 3 день после заражения, были положительными как при тестировании в ПЦР в режиме реального времени (ранее полученные результаты), так и при тестировании с использованием тест-системы Skylamp ScanSpace в исполнении ASF- Scanpoint. Аналогичные результаты были получены и при тестировании образцов сывороток, цельной крови и смывов с носовой полости, отобранных на 5 и 7 день после инфекции. Таким образом, с использованием тест- системы Skylamp ScanSpace в исполнении ASF-Scanpoint геном вируса АЧС был выявлен в 100% случаев при тестировании образцов сыворотки, цельной крови и смывов с носовой полости инфицированных животных.

3. Сравнительный анализ тест-системы Skylamp ScanSpace в исполнении ASF-Scanpoint с набором РеалБест-Вет ДНК ASFV (Африканская чума свиней) («Вектор-БЕСТ» Россия) был проведен для подтверждения полученных результатов. Для исследования были использованы образцы сыворотки, отобранные на 3, 5 и 7 день после заражения вирулентным штаммом Ставрополь_01/08, а также сыворотки неинфицированных животных. Наборы Skylamp ScanSpace и РеалБест-Вет ДНК ASFV (Африканская чума свиней) («Вектор-БЕСТ» Россия) показали сходные показатели чувствительности и специфичности при тестировании небольшого числа сывороток (Таблица 1).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Набор Skylamp ScanSpace в исполнении ASF-Scanpoint продемонстрировали высокую специфичность и чувствительность в отношении штаммов АЧС, циркулирующих на территории РФ, и соседних странах. Наборы Skylamp ScanSpace и РеалБест-Вет ДНК ASFV (Африканская чума свиней) («Вектор-БЕСТ» Россия) показали сходные показатели чувствительности и специфичности при тестировании небольшого числа сывороток. При этом время получения результата при использовании Skylamp ScanSpace оказалось значительно короче, благодаря упрощенной процедуре подготовки проб и проведения изотермической ПЦР. Полученные данные свидетельствуют, что набора Skylamp ScanSpace в исполнении ASF-Scanpoint позволяет выявлять геном вируса АЧС в образцах биологического материала (культурах клеток, сыворотках, цельной крови и смывов с носовой полости). Использования в будущем большего числа образцов от инфицированных животных, включая полевые образцы, позволит изучить диагностическую чувствительность и специфичность предложенного набора.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. African swine fever virus replication and genomics/ L.K. Dixon, D.A. Chapman, СL Netherton, C. Upton // Virus Res. - 2013. - Vol. 173, № 1. - P. 3–14.

2. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterization / A.D. Bastos, M.L. Penrith, C. Crucière et al. // Arch Virol. - 2003. -Vol. 148, N4. - P. 693–706.

3. Genetic characterization of African swine fever virus isolates from soft ticks at the wildlife/domestic interface in Mozambique and identification of a novel genotype/ C.J. Quembo,

F. Jori, W. Vosloo, L. Heath, // Transbound. Emerg. Dis. – 2018. – Vol. 65, № 2. – P. 420-431.

4. The 2022 Outbreaks of African Swine Fever Virus Demonstrate the First Report of Genotype II in Ghana/ E. Spinard, A. Rai, J. Osei-Bonsu, V. O’Donnell et al. // Viruses. - 2023. - Vol. 15, N8: 1722.

5. Reclassification of ASFV into 7 Biotypes Using Unsupervised Machine Learning/

M. Dinhobl, E. Spinard, N. Tesler et al. // Viruses. – 2024. - Vol. 16:67.

6. Analysis of the Unique Historical Isolate of African Swine Fever Virus Isolate Spencer from Outbreaks in 1951/ E. Spinard, M. Dinhobl, J. Fenster, C et al. // Viruses. - 2024. - Vol. 16, N8 : 1175.

7. Sereda A.D. Antigenic diversity of African swine fever viruses/ A.D. Sereda,

V.M. Balyshev // Vopr. Virusol. – 2011. - Vol. 56, N4. – P. 38–42.

8. Vishnjakov, I. F. Seroimmunological classification of African swine fever virus natural isolates/ I. F. Vishnjakov, N.I. Mitin, J.I. Petrov // In Topical Issues of Veterinary Virology. Proceedings of the Conference VNIIVViM: Classical Swine Fever Urgent Problems of Science and Practice. – Pokrov, VNIIVViM (in Russian), 1995. – P. 141–143.

9. Protective Properties of Attenuated Strains of African Swine Fever Virus Belonging to Seroimmunotypes I–VIII/ A.D. Sereda, V.M. Balyshev, A.S. Kazakova, A.R. Imatdinov, D.V. Kolbasov // Pathogens. - 2020. – Vol. 9, N4 : 274.

10. https://fsvps.gov.ru/wp- content/uploads/2024/12/03_%D0%90%D0%A7%D0%A1_2007_2024_%D1%8D%D0%BF% D0%B8%D0%B4%D1%81%D0%B8%D1%82%D1%83%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F

_%D0%A6%D0%92.png

11. Thomson G.R, The epidemiology of African swine fever: the role of free-living hosts in Africa / G.R. Thomson // Onderstepoort J. Vet. Res. – 1985. – Vol. 52, N3. – P. 201– 209.

12. Review of the sylvatic cycle of African swine fever in sub-Saharan Africa and the Indian ocean / F. Jori, L. Vial, M.L. Penrith et al. // Virus Res. - 2013. – Vol. 173. – P. 212– 227.

13. African Swine Fever Virus Isolate, Georgia, 2007/ R.J. Rowlands, V. Michaud, L. Heath et al. // Emerg. Infect. Dis. – 2008. – Vol. 14, N 12 – P. 1870-1874.

14. African swine fever. Technical Disease Card / World Organisation for Animal Health. - URL: https://www.woah.org/en/disease/african-swine-fever/#ui-id-2

15. Genotype I African swine fever viruses emerged in domestic pigs in China and caused chronic infection/ E, Sun, L. Huang, X. Zhang et al. // Emerg. Microbes Infect. – 2021. – Vol.10, N1. – P. 2183–2193.

16. Highly lethal genotype I and II recombinant African swine fever viruses detected in pigs/ D. Zhao, E. Sun, L. Huang et al. // Nat. Commun. - 2023. – Vol. 14, N1: 3096.

17. Detection of Recombinant African Swine Fever Virus Strains of p72 Genotypes I and II in Domestic Pigs, Vietnam, 2023/ V.P. Le, V.T. Nguyen, T.B. Le et al. // Emerg. Infect. Dis. - 2024. - Vol. 30, N5. – P. 991–994.

18. Molecular Characterization of Emerging Recombinant African Swine Fever Virus of Genotype I and II in Vietnam, 2023/ K. Lee, T.T. Hang Vu, M. Yeom et al. // Emerg. Microbes Infect. - 2024. - Vol. 13, N1: 2404156.

19. Detection of the first recombinant African swine fever virus (genotypes I and II) in domestic pigs in Russia/ Igolkin A, Mazloum A, Zinyakov N, Chernyshev R, Schalkwyk AV, Shotin A, Lavrentiev I, Gruzdev K, Chvala I.// Mol Biol Rep. 2024 Sep 25;51(1):1011. doi: 10.1007/s11033-024-09961-0.

20. African swine fever in the North Caucasus region and the Russian Federation in years 2007–2012/ A. Gogin, V. Gerasimov, A. Malogolovkin, D. Kolbasov // Virus Res. – 2013. – Vol. 173, N1. – P. 198-203.

21. African Swine Fever Virus, Siberia, Russia, 2017/ D. Kolbasov, I. Titov, S. Tsybanov, A. Gogin, A. Malogolovkin // Emerg. Infect. Dis. – 2018. – Vol. 24, N4. – P. 796- 798.

22. African swine fever virus Georgia isolate harboring deletions of MGF360 and MGF505 genes is attenuated in swine and confers protection against challenge with virulent parental virus / V. O’Donnell, L.G. Holinka, D.P. Gladue // J. Virol. – 2015. – Vol. 89, N 11. – P.6048-6056.

23. Quality Control of a Live—Attenuated African Swine Fever Vaccine in Viet Nam/ H.L. Ta // WOAH Regional Representation for Asia and the Pacific: Tokyo, Japan. - 2022.

24. Development of a Highly Effective African Swine Fever Virus Vaccine by Deletion of the I177L Gene Results in Sterile Immunity against the Current Epidemic Eurasia Strain/ M.V. Borca, E. Ramirez-Medina, E. Silva et al. // J. Virol. - 2020. – Vol. 94, N7. – P. 17-19.

25. African swine fever virus vaccine candidate ASFV-G-∆I177L efficiently protects European and native pig breeds against circulating Vietnamese field strain/ X.H. Tran, T.T.P. Le,

Q.H. Nguyen et al. // Transbound. Emerg. Dis. – 2022. – Vol. 69, N4: e497-e504.

26. African swine fever virus (ASFV) protection mediated by NH/P68 and NH/P68 recombinant live-attenuated viruses/ C. Gallardo, E.G. Sanchez, D. Perez-Nunez et al. // Vaccine. – 2018. – Vol. 36, N19. – P. 2694–2704.

27. Simultaneous Deletion of the 9GL and UK Genes from the African Swine Fever Virus Georgia 2007 Isolate Offers Increased Safety and Protection against Homologous Challenge / V. O’Donnell, G.R. Risatti, L.G. Holinka et al. // J Virol. - 2017. - Vol. 91, N1:e01760-16.

28. A seven-gene-deleted African swine fever virus is safe and effective as a live attenuated vaccine in pigs/ W. Chen, D. Zhao, X. He et al. // Sci. China Life Sci. – 2020. – Vol. 63, N5. – P. 623–634.

29. Deletion of African swine fever virus interferon inhibitors from the genome of a virulent isolate reduces virulence in domestic pigs and induces a protective response/ A.L. Reis,

C.C. Abrams, L.C. Goatley et al. // Vaccine. – 2016. – Vol. 34, № 39. – P. 4698-4705.

30. Deletion of the African Swine Fever Virus Gene DP148R Does Not Reduce Virus Replication in Culture but Reduces Virus Virulence in Pigs and Induces High Levels of Protection against Challenge/ A. L. Reis, L.C. Goatley, T. Jabbar et al. // J. Virol. – 2017. – Vol. 91, N24 : e01428-17.

31. Deletion of the A137R Gene from the Pandemic Strain of African Swine Fever Virus Attenuates the Strain and Offers Protection against the Virulent Pandemic Virus/ D.P. Gladue, E. Ramirez-Medina, E. Vuono et al. // J. Virol. – 2021 - Vol. 95, N21:e0113921.

32. Recombinant African Swine Fever Virus Arm/07/CBM/c2 Lacking CD2v and A238L Is Attenuated and Protects Pigs against Virulent Korean Paju Strain/ D. Perez-Nunez,

S.Y. Sunwoo, R. Garcia-Belmonte et al. // Vaccines. – 2022. - Vol.10, N12 :1992.

33. BA71DCD2: A new recombinant live attenuated African swine fever virus with cross-protective capabilities/ P.L. Monteagudo, A. Lacasta, E. López et al. // J. Virol. – 2017. – Vol. 91, N21:e01058-17.

34. Deletion of the L7L-L11L genes attenuates ASFV and induces protection against homologous challenge/ J. Zhang, Y. Zhang, T. Chen et al. // Viruses. - 2021. – Vol. 13, N2:255.

35. Reeed L.J. A simple method of estimating fifty per cent endpoints12/ L. J. Reed,

H. Muench // Am. J. Epidemiol. – 1938. - Vol. 27, № 3. - P. 493–497.

36. Towards Safe African Swine Fever Vaccines: The A137R Gene as a Tool to Reduce Virulence and a Promising Serological DIVA Marker Candidate/ Koltsov, A.; Sukher, M.; Krutko, S.; Belov, S.; Korotin, A.; Rudakova, S.; Morgunov, S.; Koltsova, G. // Animals 2024, 14, 2469. https://doi.org/10.3390/ani14172469

37. Construction of the First Russian Recombinant Live Attenuated Vaccine Strain and Evaluation of Its Protection Efficacy Against Two African Swine Fever Virus Heterologous Strains of Serotype 8. / Koltsov, A.; Sukher, M.; Krutko, S.; Belov, S.; Korotin, A.; Rudakova, S.; Morgunov, S.; Koltsova, G. // Vaccines 2024, 12, 1443. https://doi.org/10.3390/vaccines12121443